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        線粒體檸檬酸含量測(cè)試定試劑盒 微量法

測(cè)定意義：CA是線粒體三羧酸循環(huán)的*個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。

測(cè)定原理：CA在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰，該波長(zhǎng)下吸光度的變化程度可反映出CA的含量。

需要的儀器，耗材:可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽、蒸餾水。 

          線粒體檸檬酸含量測(cè)試定試劑盒 微量法

試劑組成和配制：酸性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。堿性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；標(biāo)準(zhǔn)液：液體 1mL×1 支，10μmol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提取：稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃ 離心 5min；取上清另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測(cè)定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。測(cè)定步驟： 1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 330nm，蒸餾水調(diào)零。 2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。 3、樣本測(cè)定：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個(gè)。試劑名稱(μL) 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測(cè)定管試劑一 60 60 60 蒸餾水 60 標(biāo)準(zhǔn)液 60 樣本 60 試劑二 20 20 20 試劑三 60 60 60 充分混勻，330nm 立即測(cè)定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。檸檬酸含量計(jì)算：（1）按蛋白濃度計(jì)算檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷Cpr 蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。（2）按樣本鮮重計(jì)算檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V 樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷W C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μmol/mL； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.06mL；V 樣總：加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。注意：檢測(cè)限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。

 相關(guān)文獻(xiàn)：

《Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis》 作者:Meixi Peng, Dan Yang, Yixuan Hou, Shuiqing Liu, Maojia Zhao, Yilu Qin, Rui Chen, Yong Teng & Manran Liu 期刊:Cell Death and Disease 影響因子:5.959 PMID:30850587