CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8）是一種基于WST-8的快速、高靈敏度細胞活性檢測的試劑盒，廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的檢測。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性甲臜化合物。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同種類型細胞，顏色深淺與細胞數(shù)量在一定限度內(nèi)呈線性關(guān)系。

本試劑盒為即用型溶液，無需再行配制，可直接用于96孔板細胞實驗，省略了細胞洗滌與收集等步驟。該試劑盒可用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測。

操作步驟：（僅供參考）

一、制作標準曲線

1.先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞。

2.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3.接種后培養(yǎng)至細胞貼壁，然后加CCK-8溶液培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。

4.根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。）

二、細胞活性檢測

1.在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37℃，5% CO2的條件下）。

2.向每孔加入 10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

4.用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5.如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板在室溫條件下避光保存。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

 三、細胞增值-毒性檢測

1.在 96 孔板中配置 100μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（在 37 ℃，5% CO2 的條件下）。

2.向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段時間（例如：6、12、24或48小時）。

3.向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8溶液之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。

4.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5.如果暫時不測定 OD 值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

活力計算：

細胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養(yǎng)基和 CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項：

1.本試劑顏色應(yīng)為粉紅色，如果發(fā)現(xiàn)溶液變黃應(yīng)棄用。

2.由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液。

3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。

4.建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間，白細胞可能培養(yǎng)時間較長。

5.當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔 (100μL培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個/孔 (100μL培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6.如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450nm檢測靈敏度最高。

7.培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

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標題:Bisphenol A and Polychlorinated Biphenyls Enhance the Cancer Stem Cell Properties of Human Ovarian Cancer Cells by Activating the WNT Signaling Pathway

成員:郭一凡

論文因子:5.108 31918092

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標題:A self-powered intracardiac pacemaker in swine model

成員:Liu Zhuo, Hu Yiran, Qu Xuecheng, Liu Ying, Cheng Sijing, Zhang Zhengmin, Shan Yizhu, Luo Ruizeng, Weng Sixian, Li Hui, Niu Hongxia, Gu Min, Yao Yan, Shi Bojing, Wang Ningning, Hua Wei, Li Zhou, Wang Zhong Lin

論文因子:16.6 發(fā)表期刊:Nature Communications pmid:38218947

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標題:Biomimetic manganese-eumelanin nanocomposites for combined hyperthermia-immunotherapy against prostate cancer

成員:惠輝

論文因子:10.435 發(fā)表期刊:Journal of Nanobiotechnology pmid:35073918

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注意：以上文獻 僅供參考

CCK-8試劑盒(細胞增殖及毒性檢測試劑盒)

CCK-8試劑盒(細胞增殖及毒性檢測試劑盒)