----PCR反應(yīng)引物設(shè)計

PCR反應(yīng)中引物起著很重要的作用。模板的不同、欲擴增的片段不同、需要的片段長度不同或者是用途不同等等，對引物的要求是不一樣的。PCR作為一種體外酶促反應(yīng)，其效率和特異性主要取決于兩個方面，一是引物和模板結(jié)合的特異性，二是多聚酶對引物的有效延伸。引物設(shè)計的總原則就是提高擴增的效率和特異性。引物設(shè)計的原則一般遵循下列幾項：

1、引物的長度以15～30bp為宜。引物過短會使特異性降低，過長則成本增加，而且也會降低特異性。常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。

2、引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C的含量在45～55%之間比較適宜，另外上下游引物的GC含量不宜差別過大。

3、引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補鏈存在。二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。。

4、引物的堿基順序不應(yīng)與非擴增區(qū)有較高的同源性，減少非特異性擴增的產(chǎn)生。

5、引物3’末端堿基注意事項：原則上要求引物3’末端與模板DNA一定要配對。另外引物3’末端的末位堿基在很大程度上影響著酶的延伸效率。有資料表明，引物3’末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)率存在很大的差異。當(dāng)末位堿基是A時，即使在錯配的情況下，也能引發(fā)鏈的合成，而在末尾堿基是T時，錯配時引發(fā)效率大大降低。引物3’末端最好不要選A.

6、引物5’末端堿基選擇注意事項：引物5’末端堿基并沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，5’端堿基可以不與模板DNA配對而成游離狀態(tài)。引物設(shè)計時可以在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點或其他短的序列，可加啟動子ATG，可加錯配堿基引起突變。文獻中報道，在引物5’末端加入10個游離的堿基并不影響PCR反應(yīng)的進行。

目前較為常用的引物設(shè)計軟件有：Primer Premier 5.0、Oligo 6.