活性氧檢測試檢測流程：從探針加載到信號輸出
探針加載（細胞預(yù)處理）
步驟：
將細胞接種于培養(yǎng)板（如96孔板），待貼壁后更換無血清培養(yǎng)基（避免血清干擾）。
加入終濃度為5-20μM的探針（如DCFH-DA），37℃孵育20-30分鐘。
關(guān)鍵點：
探針濃度需優(yōu)化：過高導(dǎo)致背景噪聲，過低降低靈敏度。
避光操作：熒光探針易被光淬滅，需用錫箔紙包裹培養(yǎng)板。
ROS誘導(dǎo)（刺激處理）
目的：人為提高細胞內(nèi)ROS水平，模擬病理或應(yīng)激狀態(tài)。
常用刺激物：
氧化劑：H?O?（100-500μM）、叔丁基過氧化氫（t-BHP）。
藥物：抗腫瘤藥（阿霉素）、抗生素（慶大霉素）。
物理刺激：紫外線照射、高濃度葡萄糖（模擬糖尿病環(huán)境）。
處理時間：根據(jù)刺激物強度調(diào)整（如H?O?處理1-4小時）。
信號捕獲（熒光檢測）
方法：
流式細胞術(shù)：單細胞水平分析ROS分布，區(qū)分不同亞群（如活細胞、凋亡細胞）。
熒光顯微鏡：觀察ROS在細胞內(nèi)的定位（如線粒體、細胞核）。
多功能酶標(biāo)儀：批量檢測培養(yǎng)孔中整體熒光強度（適合高通量篩選）。
數(shù)據(jù)分析：
熒光強度與ROS水平呈正相關(guān)，需扣除空白對照（未加探針的細胞）和陰性對照（未刺激的細胞）。
質(zhì)量控制與干擾排除
內(nèi)源性干擾因素
細胞狀態(tài)：死亡細胞釋放內(nèi)容物可能非特異性結(jié)合探針，需通過臺盼藍染色排除死細胞。
培養(yǎng)基成分：酚紅（培養(yǎng)基pH指示劑）在綠色通道有自發(fā)熒光，需使用無酚紅培養(yǎng)基或選擇紅色熒光探針（如DHE）。
探針穩(wěn)定性
光淬滅：熒光探針易被光分解，檢測前需嚴格避光，檢測后立即讀取數(shù)據(jù)。
氧化自反應(yīng)：部分探針（如DCFH）在空氣中可能緩慢氧化，需現(xiàn)用現(xiàn)配或分裝凍存。
交叉反應(yīng)驗證
特異性測試：同時使用多種探針（如DCFH-DA+DHE）檢測不同ROS，確認結(jié)果一致性。
抑制劑驗證：加入ROS清除劑（如NAC、SOD）后，熒光信號應(yīng)顯著下降。
技術(shù)擴展：非熒光檢測方法
化學(xué)發(fā)光法
原理：魯米諾（Luminol）與H?O?在辣根過氧化物酶（HRP）催化下發(fā)光，光強與ROS水平相關(guān)。
優(yōu)勢：無需激發(fā)光，背景噪聲低，適合檢測低濃度ROS。
比色法
原理：ABTS（2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)）被ROS氧化為綠色產(chǎn)物，通過吸光度（650nm）定量。
應(yīng)用：適用于組織勻漿或體液（如血液、尿液）中ROS的快速檢測。
更新時間：2025-09-10
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