平時研究用的細胞，有需要冷凍保存。冷凍的過程稱為凍存，把凍上的細胞化開的過程叫細胞復(fù)蘇。細胞復(fù)蘇是一簡單的試驗操作，但操作中有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小問題，才能使復(fù)蘇后的細胞狀態(tài)保持良好。

細胞復(fù)蘇實驗準備：

主要器材：一次性滴管、打火機、酒精燈、大鑷子、中鑷子、記號筆、廢液缸、封口膜、剪子。

主要試劑： PBS、培養(yǎng)液、消化酶（胰酶）、75%酒精、雙抗。

PBS配制：NaCL :4g   KCL:0.1g   Na2HPO4 :1.745g   KH2PO4 :0.1g   

三蒸水： 500mL，溶解后高壓滅菌。

培養(yǎng)基配制：5mL雙抗、50mL血清，加入培養(yǎng)基中。

細胞復(fù)蘇操作步驟：

1.佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

2.迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其充分融化，然后在無菌下取出細胞。

3.在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代。或無需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞復(fù)蘇的注意事項：

1.細胞復(fù)蘇時要注意融化凍存細胞的應(yīng)注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5～0℃)。

2.凍存液對細胞有毒性，解凍后必須用Dhanks洗兩遍才能移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中血清不能太少。

3.從液氮拿出來，以最快速度丟入37度水浴，等細胞液剛剛化完取出，加培養(yǎng)液稀釋。這樣可以避免復(fù)蘇過程中細胞液中有冰晶的出現(xiàn)，冰晶會破壞細胞膜及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的。

4.剛復(fù)蘇的細胞還是少折騰它好，細胞37°快速解凍后直接放入預(yù)熱的培養(yǎng)基。

5.DMSO在4度以下對細胞無毒，4度以上有毒；復(fù)蘇必須盡快除去。要記得慢凍速溶！

6.取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

7.常溫下二甲基亞砜（DMSO）對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2 min內(nèi)使凍存液充分融化。如果復(fù)蘇溫度太低，會造成細胞的損傷，所以選擇40℃復(fù)蘇。8.貼壁細胞復(fù)蘇實驗標準流程是將解凍后的細胞懸液先進行離心，以去除冷凍保護液DMSO對細胞的損傷，但是離心也會對剛復(fù)蘇的狀態(tài)欠佳的細胞產(chǎn)生損傷。也有的實驗操作是將解凍后的細胞懸液先直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。這可能使培養(yǎng)基中少量的DMSO對細胞造成損傷。

細胞復(fù)蘇后貼壁細胞較少的原因有哪些：

1.凍存細胞的時候是不是消化時間過長，這是一般人注意不到的地方，要知道太長的消化時間會使細胞復(fù)蘇時失去貼壁能力。

2.有可能是細胞凍存液的質(zhì)量，細胞凍存液的質(zhì)量不好也會導(dǎo)致細胞死亡。

3.凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過7%，大于5%，太多也不好。

4.凍存的時候是不是把DMSO混均勻，這個有一些影響，但不算太大。

5.凍存時溫度梯度是不是把握嚴格，很多人容易忘卻這個事情，因為這個東西流程長。