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近年來，隨著病理學(xué)研究領(lǐng)域的不斷深入，多重免疫標(biāo)記技術(shù)逐步興起。多重免疫標(biāo)記技術(shù)是一種可以在同張組織樣本上實(shí)現(xiàn)多重分子標(biāo)記的免疫標(biāo)記技術(shù)，配合定量分析工具，能夠?qū)M織微環(huán)境中目標(biāo)分子或細(xì)胞及其相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行全面分析。

傳統(tǒng)免疫熒光多重標(biāo)記的基本模式是：第一抗體選擇不同的種屬來源，不同顏色的熒光二抗結(jié)合一抗時(shí)要滿足種屬匹配，區(qū)分不同種標(biāo)記。

而今天小編給大家介紹的是一種基于經(jīng)典HRP顯色免疫標(biāo)記技術(shù)的熒光多重標(biāo)記檢測方法，即酪酰胺信號放大（TSA）技術(shù)。TSA標(biāo)記法是一項(xiàng)基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術(shù)，可以在細(xì)胞或組織樣本原位檢測多個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)，通過這些靶點(diǎn)的組合和位置關(guān)系的研究，進(jìn)而闡明其相互作用機(jī)理，對于疾病診療和病理診斷有著重要意義。

TSA技術(shù)的染色流程與經(jīng)典免疫組織化學(xué)染色步驟相近，值得注意的是，依次加入一抗的過程中，額外增加了修復(fù)熱處理洗脫步驟，該步驟可以將以非共價(jià)鍵結(jié)合在抗原上的抗體去除，但是仍然保留以共價(jià)鍵結(jié)合在抗原表面的TSA熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)無抗體干擾的抗原直接標(biāo)記，再經(jīng)過多輪染色循環(huán)實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記，無需考慮多種抗體之間的非特異反應(yīng)。直至全部標(biāo)記完成，復(fù)染DAPI后封片觀察即可。

1. TSA標(biāo)記是穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合，熒光信號穩(wěn)定，基本不受連續(xù)孵育、熱修復(fù)和抗體剝離處理影響；

2. 可以使用同一種屬的不同一抗搭配同一二抗使用，極大減少交叉反應(yīng)對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。而且可以連續(xù)染色最后觀察也可逐步染色檢查染色結(jié)果；

3. 搭配強(qiáng)力過氧化物酶封閉液能有效去除本底酶活和殘留抗體對結(jié)果的影響；

4. 通過組合使用不同的TSA熒光染料，可對切片樣本進(jìn)行單標(biāo)記放大標(biāo)記到最多6重抗體標(biāo)記同切片顯示。

1. 修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定；

2. TSA原理的多重?zé)晒饷庖呓M化中，由于染料是依次共價(jià)偶聯(lián)在切片上的，并需要通過加熱洗去前續(xù)抗體，因此需要確定染色順序，以保證：

A. 多次加熱切片不會影響后續(xù)靶點(diǎn)表位完整性；

B. 前續(xù)偶聯(lián)的熒光素能耐受后續(xù)加熱過程。

3. 多重染色需要平衡待檢樣品中靶點(diǎn)峰度和各通道信號強(qiáng)度。盡量做到：寡靶配強(qiáng)光，眾靶配弱光。

4. TSA增強(qiáng)信號會比熒光標(biāo)記二抗信號高10-100倍，能夠使用更少抗體標(biāo)記的同時(shí)也更容易由于抗體濃度過高造成非特異性著色。因此正式染色之前，建議先摸索各通道下每一個(gè)單抗的最佳濃度范圍。

5. 鑒于多通道曝光時(shí)間較長，須使用有效抗熒光衰減封片劑封片。亦可使用含DAPI的抗熒光衰減封片劑。